Caspase-3活性检测试剂盒 (比色法)

Caspase-3活性检测试剂盒 (比色法)

Caspase全称为含半Cystine的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase)。Caspase 是一类蛋白酶家族，成员较多，该家族已显示在凋亡中起关键作用。哺乳动物caspases 可分为三个功能组：启动子半胱天冬酶（Caspase-2、8、9 和 10），执行者半胱天冬酶（Caspase-3、6 和 7）和炎性半胱天冬酶（Caspase-3、4、5、11 和 12）。Caspase-3（也称为Yama，CPP32 和 Apopain）在天冬氨酸残基的羧基末端切割其底物。活性 Caspase-3由两组同源二聚体（17 和 12 kDa） 组成，它们均来自两个前体 Caspase -3 多肽，并具有两个活性位点。Caspase-3 与 Caspases-8 和 9一起位于细胞凋亡途径的关键连接点。本试剂盒基于Caspase-3 水解肽底物Ac-DEVD-pNA（acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-对硝基苯胺），产生黄色的对硝基苯胺（pNA），pNA 在405nm 附近有强吸收,从而可以通过测定吸光度来检测 Caspase-3的活性。

注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。

细胞裂解液: 使用前按1mL细胞裂解液加入10 µL DTT的比例加入DTT，置于冰上备用。

1×反应缓冲液 (含 DTT): 使用前将反应缓冲液（2×）加等体积去离子水稀释到反应缓冲液 (1×)，再按1mL反应缓冲液 (1×)加入10µL DTT的比例加入DTT，置于冰上备用。

底物: 即用型；实验过程中置于冰上；–20℃保存。用不完的试剂-20℃避光分装保存，避免反复冻融。

DTT : 即用型；实验过程中置于冰上；–20℃保存。用不完的试剂-20℃分装保存，避免反复冻融。

标准曲线设置：取20µL pNA标准品 (10mM)用180µL 1×反应缓冲液(含 DTT)稀释至1000µM pNA标准品。用1000µM pNA按下表所示，进行下一步稀释：

注意：每次实验，请使用新配制的标准品。用不完的标准品-20℃避光分装保存，避免反复冻融

1. 通过所需方法诱导细胞凋亡。同时，建议对每个样本设置不诱导的对照培养。

对于贴壁细胞，Trypsin消化收集细胞。600g，4℃离心5min，小心吸去上清液。用1mL PBS洗涤细胞2次。离心后，去除上清液。在1mL细胞裂解液中重悬 5×106个细胞。

对于悬浮细胞，600g，4℃离心5min，小心吸去上清液。用1mL PBS 洗涤细胞2次。离心后，去除上清液。在1mL细胞裂解液中重悬 5×106个细胞。

对于组织，将0.1g组织切成小块，用PBS清洗组织，加入1mL细胞裂解液，冰浴匀浆。

2. 裂解物冰上孵育 15-20min。

3. 16,000g，4℃离心15min，然后将上清液转移至新EP管中，置冰上待测。

4. 立即测定 Caspase-3 的酶活性或-80℃保存样品。同时可以取少量样品用 Bradford 法测定蛋白浓度。

注意：1. 推荐使用新鲜样品。如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存一个月，使用前，在冰上解冻。

2. 在样品制备步骤中请勿使用蛋白酶抑制剂，可能会干扰测定。

3. 如需测定蛋白浓度，推荐使用Bradford 法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。

1. 酶标仪预热30min以上，调节波长到405nm。

2. 操作表（下述操作在96孔板中操作）：

3. 混匀，37℃孵育1-2h，检测405nm处吸光值。空白孔记为A空，标准孔记为A标、测定孔记为A测。计算 ΔA测=A测-A空，ΔA标=A标-A空。

注意：1.空白孔只需测定1次。实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验；如果ΔA测小于0.001可适当加大样本量，如果ΔA测大于1.0，用细胞裂解液适当稀释样品后再进行测定，计算结果乘以稀释倍数。

2.在反应体系中，适当混匀，注意避免在混匀时产生气泡；3.发现颜色变化比较明显时即可测定405nm 的波长。如果颜色变化不明显，可以适当延长孵育时间，甚至可以孵育过夜。

结果计算：

1. 标准曲线的绘制：

以ΔA 标为x轴，标准溶液浓度为y轴，绘制标准曲线（浓度为y轴更方便计算结果）。将样本的 ΔA测带入方程得到y值（μM即nmol/mL）。

2. Caspase-3 活性的计算

（1）按蛋白浓度计算

活性单位定义：为当底物饱和时，37℃环境下，每毫克蛋白在反应体系中每小时剪切1nmol pNA 底物产生1nmol游离pNA 的酶量定义为1个酶活力单位。

Caspase-3 活性（U/mg prot）=y×V反总÷(V样×Cpr)÷T=2.1×y÷Cpr÷T

（2）按样本鲜重计算

活性单位定义：为当底物饱和时，37℃环境下，每克样本在反应体系中每小时剪切1nmol pNA 底物产生1nmol游离pNA 的酶量定义为1个酶活力单位。

Caspase-3 活性（U/g 鲜重)=y×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T=2.1×y÷W÷T

（3）按细胞数量计算

活性单位定义：为当底物饱和时，37℃环境下，每104个细胞在反应体系中每小时剪切1nmol pNA 底物产生1nmol游离pNA 的酶量定义为1个酶活力单位。

Caspase-3 活性（U/104 cell)=y×V反总÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T=2.1×y÷细胞数量÷T

V反总：反应体系总体积，0.105mL；V样：加入的样本体积，0.05mL；T：反应时间，h；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品鲜重，g；V样总：加入提取液的体积，1mL；细胞数量：以万为单位的细胞数量。